宏基因组binning的原理是什么
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在宏基因组中分离单基因组，可利用序列特征或序列组装信息，常见的可用信息主要有以下几种：
a.根据核酸使用频率（通常是四核苷酸频率）、GC含量和必需的单拷贝基因等基因组特征；
b.根据contig序列的覆盖度coverage信息；
c.根据测序数据的kmer丰度信息；
d.根据序列在不同样品的共出现规律（co-abundance patternsacross multiple samples）；
e.将序列map到数据库的参考序列所获得的注释信息，也即物种binning。
根据所使用的序列数据不同，binning策略可分为三种：基于组装前的clean reads，基于组装后的contigs，基于注释的基因genes。
⑴基于reads binning
环境样本中微生物的丰度不同，其基因组kmer的期望深度也不同，根据kmer丰度可以直接对reads进行聚类，将属于不同基因组的reads分离开来。其优势是可以聚类出宏基因组中丰度非常低的物种，而且可以分离系统发育关系很近的物种。考虑到在宏基因组组装中reads利用率很低，单样品5Gb测序量情况下，环境样品组装reads利用率一般只有10%左右，肠道样品或极端环境样品组装reads利用率一般能达到30%，这样很多物种，尤其是低丰度的物种的reads没有被没有被组装出来，没有体现在contig中而被浪费，因此基于reads binning才有可能得到低丰度的物种基因组的的测序数据，在实际研究中基于reads binning的LSA（Latent Strain Analysis）方法可以聚类出丰度低到0.00001%的物种，并且对同一物种中的不同菌株的敏感性很强[2]。
⑵基于genes binning
在宏基因组做完序列组装和基因预测之后，把所有样品中预测到的基因混合在一起，去冗余得到unique genes集合，根据gene在各个样品中的丰度变化模式，计算gene之间的相关性，利用这种相关性进行聚类。利用这种策略进行binning得到的bins可称为CAG（co-abundance genegroups），包含有700个以上的gene的CAG称为MGS（metagenomic species），CAG可用进行关联分析，MGS可用进行后续的单菌组装[3]。当然根据具体的聚类算法和相关性系数的不同，对genes binning得到的bins的叫法也不同，除以上外还有MLG（metagenomic linkage groups）、MGC（metagenomic clusters）和MetaOTUs（metagenomic operational taxonomicunits）等，同时，MLG, MGC, MGS和MetaOTUs物种注释的标准也是不一样的。
目前已发表的宏基因组关联分析（MWAS）和多组学联合分析文章中，宏基因组binning很多都用genes binning方法，尤其是疾病的MWAS研究中基本都用genes binning[4]。这种方法的优势是基于genes丰度变化模式进行binning可操作性比较强，过程比较简单，可复制性强，对计算机资源消耗比较低。
⑶基于contigs binning
在宏基因组做完序列组装之后，将所有reads序列map到contigs上获得contig覆盖率，再综合GC含量、核算组成等信息对contig进行聚类，将属于不同基因组的contig序列分开。contig binning目前应用十分广泛，最常用的就是用于组装单物种基因组，目前已经有多种基于contig binning的软件[1]，对于丰度较高的物种contigs binning效果较好，但是目前也有些缺陷或者说还有很多可提升的空间，例如对核酸组成信息的利用，开发得就不够充分，四碱基使用频率因简单而被广泛使用和接受，但现在已有研究表明k-mer丰度信息也是很好的种系特征，同时越长的k-mer含有越多的信息，还有基因和参考基因组间的同源关系也是有价值的种系信号，但这些都还没有被自动化的binning软件整合。
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